S'han conegut les seqüències genòmiques de la majoria de virus.Sondes d' àcid nucleic que són segments curts d' ADN dissenyats per hibridar amb ADN viral o segments d' ARN complementaris .La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) és una tècnica més eficient per a la detecció viral.Recentment s'han desenvolupat mètodes de diagnòstic d'alt rendiment.
A. Tècnica d'hibridació d'àcids nucleics
La hibridació d'àcids nucleics, que inclou principalment Southern blotting (Southern) i Northern blotting (Northern), és una nova tècnica de desenvolupament ràpid en el camp del diagnòstic de virus.La raó de l'assaig d'hibridació és utilitzar segments curts d'ADN (anomenats "sonda") dissenyats per hibridar-se amb ADN viral o segments d'ARN complementaris.Mitjançant l'escalfament o el tractament alcalí, l'ADN o l'ARN diana de doble cadena es separen en cadenes simples i després s'immobilitzen sobre un suport sòlid.Després d'això, s'afegeix la sonda i s'hibrida amb l'ADN o l'ARN diana.Com que la sonda està marcada amb isòtops o núclids no radioactius, l'ADN o ARN objectiu es pot detectar mitjançant autorradiografia o pel sistema biotina-avidina.Com que la majoria dels genomes virals s'han clonat i seqüenciat, es poden detectar mitjançant seqüències específiques del virus com a sondes a l'exemplar.Actualment, els mètodes d'hibridació inclouen: dot blot, hibridació in situ a les cèl·lules, DNA blotting (DNA) (Southern blot) i RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B. Tecnologia PCR
En els darrers anys, s'han desenvolupat una sèrie de tècniques d'amplificació d'àcids nucleics in vitro basades en PCR, per provar virus insensibles o no cultivables.La PCR és un mètode que pot sintetitzar seqüències específiques d'ADN mitjançant una reacció de polimerasa in vitro.El procés de PCR inclou un cicle tèrmic de tres passos: desnaturalització, recuit i extensió A alta temperatura (93 ℃ ~ 95 ℃), l'ADN de doble cadena es separa en dues cadenes simples d'ADN;després, a baixa temperatura (37 ℃ ~ 60 ℃), dos cebadors de nucleòtids sintetitzats s'apropen als segments d'ADN complementaris;mentre que a la temperatura adequada per a l'enzim Taq (72 ℃), la síntesi de noves cadenes d'ADN s'inicia des de l'extrem de l'encebador 3' utilitzant ADN complementari com a plantilles i nucleòtids únics com a materials.Així, després de cada cicle, una cadena d'ADN es pot amplificar en dues cadenes.Repetint aquest procés, cada cadena d'ADN sintetitzada en un cicle es pot utilitzar com a plantilla en el cicle següent, i el nombre de cadenes d'ADN es duplica en cada cicle, la qual cosa significa que la producció de PCR s'amplifica a una velocitat de registre de 2 n.Després de 25 a 30 cicles, la producció de PCR s'identifica mitjançant electroforesi i els productes específics d'ADN es poden observar sota llum UV (254 nm).Pel seu avantatge d'especificitat, sensibilitat i comoditat, la PCR s'ha adoptat en el diagnòstic clínic de moltes infeccions víriques com el VHC, el VIH, el CMV i el VPH.Com que la PCR és molt sensible, pot detectar l'ADN del virus a nivell de fg, l'operació s'ha de dur a terme amb molta cura per evitar falsos positius.A més, un resultat positiu a la prova d'àcid nucleic no vol dir que hi hagi virus infecciós viu a la mostra.
Amb una àmplia aplicació de la tècnica de PCR, es desenvolupen noves tècniques i mètodes basats en la tècnica de PCR per a diferents propòsits de prova.Per exemple, la PCR quantitativa en temps real pot detectar la càrrega viral;La PCR in situ s'utilitza per identificar la infecció per virus en teixits o cèl·lules;La PCR niuada pot augmentar l'especificitat de la PCR.Entre ells, la PCR quantitativa en temps real s'ha desenvolupat més ràpidament.Moltes tècniques noves, com ara la sonda d'hidròlisi TaqMan, la sonda d'hibridació i la sonda de balisa molecular, s'han combinat en la tècnica de PCR quantitativa en temps real, que s'utilitza àmpliament en la investigació clínica.A més d'identificar amb precisió la càrrega viral en el líquid corporal dels pacients, aquest mètode també es pot utilitzar per detectar mutants tolerants als fàrmacs.Per tant, la PCR quantitativa en temps real s'aplica principalment a l'avaluació d'efectes curatius i a la vigilància de la tolerància als fàrmacs.
C. Detecció d'alt rendiment d'àcids nucleics virals
Per satisfer les necessitats de diagnòstic ràpid de noves malalties infeccioses emergents, s'han establert diversos mètodes de detecció d'alt rendiment, com els xips d'ADN (ADN).Per als xips d'ADN, les sondes específiques es sintetitzen i s'uneixen a xips petits de silici de molt alta densitat per formar microarrays de sondes d'ADN (ADN) que es poden hibridar amb la mostra.El senyal d'hibridació es pot capturar mitjançant un microscopi confocal o un escàner làser i ser processat posteriorment per l'ordinador i es pot obtenir un gran conjunt de dades sobre diferents gens.Hi ha dos tipus de xip d'ADN.El "xip de síntesi" és el següent: els oligonucleòtids específics es sintetitzen directament sobre els xips.Un altre és el xip de la piscina d'ADN.Els gens clonats o els productes de PCR s'imprimeixen ordenadament a la diapositiva.L'avantatge de la tecnologia de xips d'ADN és la detecció simultània d'una gran quantitat de seqüències d'ADN.L'última versió del xip de detecció de patògens pot identificar més de 1700 virus humans alhora.La tecnologia de xips d'ADN va resoldre els problemes dels mètodes tradicionals d'hibridació d'àcids nucleics i té aplicacions molt àmplies en el diagnòstic viral i l'estudi epidemiològic.
Hora de publicació: 23-12-2020